现场核酸检测技术平台的树立
发表光阴 >2019-05-23 14:21 来源 本站原创

  刘威邹大阳 贺晓明 董德荣 黄留玉*

  束缚军疾病预防节制中央

  黄留玉研究员,博士、博士生导师,束缚军疾病预防节制所原长处,中华预防医学会常务理事、转化医学专业委员会主任委员,中国卫生监督协会常务理事。2004年毕业于河南医科大学,后来分离在军事医学科学院和第三军医大学获得硕士和博士学位。重要从事生物平安和军队疾病预防节制办理、践和技术研究。引导创建束缚军疾病预防节制所,主编《军队疾病预防节制》专著,创造系列疾病预防节制技术。掌管实现的“军队传染病监测体系和主动防控新情势研究”2014年获得军队科技提高一等奖。获得国内外创造专利30多项,发表SCI论文70多篇。

  摘要

  针对核酸检测存在的试剂必需高温保留、操纵复杂、必要仪器设备多等不适于现场应用的难题,打破外洋技术把持,创造了新型恒温核酸扩增技术——聚合酶螺旋反应,率先实现为了一个酶一对引物的恒温核酸扩增;攻克Bst聚合酶、逆转录酶、dNTP、引物等热敏生物分子常温保留技术难关,创造了一体化核酸检测管,实现的核酸检测试剂的常温储运、开盖即检和防止净化;打破核酸检测必需先提取核酸的技术常规,创造了多功效样品处理管,具有病原灭活、核酸暴露、克制物去除和定量加样等功效;胜利研发了便携式恒温实时荧光检测仪,和50多种配套检测试剂盒。集成为“一签(通俗棉签)、两管(样品处理管、核酸检测管)、一仪器”现场核酸检测技术平台,具有“三易(试剂易保留、技术易操纵、结果易判读)、一少(仪器应用少)、一快(检测光阴不超过1个小时)”的显著特色,为传染病、食物平安及实发公共卫生事件的现场检测供给了无力的技术支撑。

  前言

  核酸检测因其较高的敏感性和特异性,在传染病、食物平安等领域获得普遍应用。因为核酸检测所用的扩增酶、dNTP、引物等热敏成分必必要在-20度保留、试验操纵比较复杂、必要较多仪器设备甚至是比较昂贵的仪器设备,使核酸检测在现场难以应用。为此咱咱咱们树立一个现场核酸检测技术平台,克服了一样平常核酸检测技术的不敷。

  1、聚合酶螺旋反应技术

  核酸恒温扩增技术都是外洋创造的技术,有严厉的专利掩护。咱咱咱们颠末过程在通俗PCR引物的基础上从靶序列上取一段序列N,将这段序列加到PCR引物(F和B)的5’端,构成为了两条复合引物Ft和Bt(图1)。 构成为了既分歧于PCR、也分歧于其它恒温扩增技术的新型核酸恒温扩增技术(图1),咱咱咱们定名为聚合酶螺旋反应(Polymerase Spiral Reaction,PSR)。具有灵敏度高(最低可检测10拷贝/µl),特异性强,反应快(10-50分钟)等特色。 颠末过程改良等温扩增反应体系,添加pH指示剂和核酸荧光染料,构成为了扩增结果荧光和色彩变更两重判别(图2)。 打破了外洋的技术把持,取得了国内创造专利(ZL201410535579.1)和国际创造专利(PCT/CN2015/000493)。



图1 PSR引物构成及其在靶序列上的结合位点



图2 PSR荧光检测和色彩变更观察

  2、多功效样品处理管

  按照一样平常技术常规,核酸检测必需首先停止核酸提取。虽然核酸提取有多种办法,但操纵相对比较复杂。为此咱咱咱们提出了核酸检测只必要核酸暴露而非必需核酸提取的理念;优选出既能裂解病原暴露核酸,又不克制后续扩增反应的样品处理液;自立设计的布局简略、价钱低廉的一次性塑料管。构成为了多功效样品处理管(图3),操纵简略(图4),具有病原灭活、核酸暴露、克制物去除和定量加样等功效。经多种样本、多种病原的比较研究,到达了商用核酸提取试剂盒的应用程度(表1)。取得了三项国内专利(ZL201410333527.6;ZL201420387897.3;ZL201520738093.8;)和第一类医疗器械备案凭证一个(京经械备20170039号)。



图3、多功效样品处理管



图4、多功效样品处理管应用流程

表1、多功效样品处理管处理样品效果比较



注:结核杆菌样本提取效果荧光定量PCR结果比较,1、2、3、4分离代表样本中分歧的结核杆菌菌落数1:107 CFU/ml;2:106 CFU/ml ;3:105 CFU/ml ,4:104 CFU/ml,每个样各有一个平行对照。

  3、一体化核酸检测管

  针对核酸检测试剂必需超高温保留、操纵复杂、易净化等难题,树立了生物分子常温玻璃化际豕ひ眨姑等生物分子的常温保留光阴超过12个月;创造了防净化隔离物(ZL201210371448.5 ),能有用防止核酸扩增中发生的气溶胶净化,低落核酸检测的假阳性。将酶、引物、dNTP热让成份玻璃化到PCR管盖内,将耐热离子液放入管底,中央用防净化隔离物停止隔离,创造了全体核酸检测试剂成份的一管化预装新剂型——一体化核酸检测管(图5),实现为了试剂的常温保留,大大简化了操纵(图6)。取得了国内专利(ZL201620156170.3)和国际创造专利(PCT/CN2016/085076)。



图5、一体化核酸检测管示用意



图6、一体化核酸检测管操纵步骤

  4、便携式恒温实时荧光检测仪及配套试剂

  咱咱咱们研制的检测试剂可以或许或许根据色彩变更停止结果判定,只要有一个水浴锅共同就能睁开工作。为了使检测更精准客观,咱咱咱们研制出了一台F8型便携式恒温实时荧光检测仪,8通道、中文界面、触屏操纵,还能手机长途同步显示检测结果(图7)。胜利研发了40多种常见病原检测试剂盒。

  现场核酸检测技术平台在西非埃防控博拉疫情、赞比亚防控霍乱疫情、国度口岸检疫、军队疫情防控中胜利应用,推动了国度及军队在传染病、生物反恐和突发公共卫生事件现场节制的技术提高。



图7 F8型便携式恒温实时荧光检测仪

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